協同乳業、東京大学、東京工業大学等の共同研究　緑色蛍光タンパク質型乳酸センサーとピルビン酸センサーの開発に成功

＜ポイント＞

• 生命現象に関わる重要な分子である細胞内の乳酸およびピルビン酸の動態を可視化解析できる緑色蛍光タンパク質センサー*1の開発にそれぞれ成功しました。
• 本研究で開発した蛍光センサータンパク質は、乳酸と結合することで蛍光輝度が約5.2倍、ピルビン酸と結合することで蛍光輝度が約3.3倍に上昇します。
• ヒトiPS細胞由来心筋細胞など様々な細胞での乳酸やピルビン酸と他の細胞内分子とを2色の蛍光で同時に可視化する、デュアルカラーイメージングに適用できます。

＜研究概要＞
乳酸やピルビン酸は、グルコース代謝によって生じる重要な代謝産物です。解糖系でグルコースが分解されてATPとピルビン酸が生じ、ピルビン酸は好気条件でクエン酸回路に運ばれてさらなるATPが産生されます。一方嫌気条件では、乳酸発酵によってピルビン酸から乳酸が産生されます。細胞内の代謝状態をリアルタイムで解析するには、乳酸やピルビン酸などグルコース代謝関連分子の濃度変化を可視化できる蛍光タンパク質センサーが有効です。

本研究では、緑色蛍光タンパク質を基盤とした乳酸センサーGreen Lindoblum（Green Lactate indicator suitable for fluorescence imaging）、ピルビン酸センサーGreen Pegassos（Green Pyruvate sensing a single fluorescent protein-based probe）を開発しました。Green Lindoblumは乳酸存在下で蛍光輝度が約5.2倍に上昇し、Green Pegassosはピルビン酸存在下で蛍光輝度が約3.3倍に上昇しました。

このGreen LindoblumやGreen Pegassosを細胞に発現させ、蛍光顕微鏡で観察したところ、細胞内の乳酸およびピルビン酸濃度変化を可視化することができました。また、Green Lindoblumと赤色Ca2+蛍光指示薬Rhod2、Green Pegassosと赤色cAMPセンサータンパク質Pink Flamindoの2色同時イメージングにもそれぞれ成功しました。さらに、ヒトiPS細胞由来心筋細胞で電子伝達系を阻害する薬剤を加えた際の細胞内乳酸およびピルビン酸動態の可視化にも成功しました。

以上の結果から、Green LindoblumおよびGreen Pegassosは細胞内のエネルギー代謝をリアルタイムで解析するツールとして有用であることが示され、様々な細胞種において代謝分子の相互作用に関する研究を加速させると考えられます。


＜影響・波及効果＞
既に開発に成功している緑色蛍光タンパク質を基盤としたグルコースセンサーGreen Glifon（Green Glucose indicating fluorescent protein, Analytical Chemistry 91, 4821-4830, 2019）や、緑・赤・青色蛍光タンパク質を基盤としたマルチカラーATPセンサーMaLions（Monitoring ATP level intensity based turn on indicators, Angewandte Chemie International Edition 57, 10873-10878, 2018）も併せて使用することで、多岐にわたる細胞において、乳酸、ピルビン酸、グルコース、ATPなどが関与するエネルギー代謝の研究が加速することが期待できます。最終的には、肥満や糖尿病のような生活習慣病の病態や、正常細胞とは異なる代謝メカニズムをもつ癌の病態の解明に大きな貢献をもたらします。

*1 蛍光タンパク質センサー:蛍光タンパク質は、ある特定の波長の光（励起光）を吸収し、吸収した光よりも波長が長い光（蛍光）を放出する性質を持つ。その性質の獲得に重要な発色団という構造の付近で配列を分割し、標的分子へ結合するタンパク質の配列を融合すると、標的分子の結合によって発色団のイオン環境が変化し、蛍光タンパク質の蛍光輝度が変化する。標的分子の濃度変化や活性などを蛍光輝度の変化を通して検出する。


＜発表雑誌＞
雑誌名：Scientific Reports
論文タイトル：Green fluorescent protein-based lactate and pyruvate indicators suitable for biochemical assays and live cell imaging
著者：
原田 一貴　（東京大学大学院総合文化研究科広域科学専攻　助教）
千原 貴美　（東京大学大学院理学系研究科生物科学専攻）
早坂 優希　（東京大学大学院総合文化研究科広域科学専攻）
三田 真理恵（東京大学大学院総合文化研究科広域科学専攻）
滝沢 舞　　（東京大学大学院総合文化研究科広域科学専攻）
石田 賢太郎（株式会社マイオリッジ　主任研究員）
新井 美存　（九州大学大学院理学研究院生物科学部門　研究員）
角 沙樹　　（協同乳業株式会社研究所　研究員）
松本 光晴　（協同乳業株式会社研究所　主幹研究員）
石原 健　　（九州大学大学院理学研究院生物科学部門　教授）
上田 宏　　（東京工業大学科学技術創成研究院　化学生命科学研究所　教授）
北口 哲也　（東京工業大学科学技術創成研究院　化学生命科学研究所　准教授）
坪井 貴司　（東京大学大学院総合文化研究科広域科学専攻　教授）
DOI番号：10.1038/s41598-020-76440-4
アブストラクトURL：https://www.nature.com/articles/s41598-020-76440-4

研究内容詳細は下記をご確認ください。
東京大学プレスリリースURL： https://www.c.u-tokyo.ac.jp/info/news/topics/files/20201113sobuntsuboit01.pdf


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